[실험] plasmid의 정제

cutting & Plasmid orientation check (11/8)materials: DNA 7㎕, 10×buffer③ 2㎕, enzyme(BamH Ι)1.5㎕,D.W 10.5㎕5. Result●PlasmidDNAisolationbyKIT●Elution●PCR6. Discussion- 7. ReferencePrescott, 2006, 미생물학, Mc Grow Hill, fifth edition, pp 297-303오계현외, 2003, 미생물학실험, 신광출판사, 초판, pp 120-124Taketoshi Taniguchi, 2002, PCR 실험 노트, 월드사이언스, 초판, pp12-14김형원 외, 1998, 미생물학 실험서, 대학출판사, 초판 pp 192-194 이상섭 외, 2003, 미생물 분리와 동정, 신흥출판사, 3판, pp 93-95

정제를 했으니 당연히 우리가 원하는 단백질인 GST-RFP를 제외한 박테리아의 다른 단백질을 나타내는 밴드는 보이지 않아야 정상이다. 하지만 실험 결과를 보면, 박테리아에서 만들어진 대부분의 단백질이 나오지 않은 것은 맞다(정제는 되긴 됨). 하지만 밴드가 희미하고 가늘게 하나 보이는데, 문제는 GST-RFP fusion 단백질의 크기인 50kDa에 해당하는 밴드 크기가 아닌, 그냥 GST에 해당하는 26kDa에 해당하는 밴드가 나왔다는 말이다. 하지만 정확히 신뢰할 수

실험3 Gel Purification◈ PurposeAgarose gel 에서 DNA band를 추출한다.◈ Principle-isopropanol:Plasmid DNA를 침전시킨다. 전기영동의 결과로 얻은 gel DNA band를 순순하게 정제 하는 단계이다. 먼저 DNA분리를 위해 60℃에서 gel을 녹여준다. 그리고 membrane filter를 사용하여 DNA만 걸러준다. Membrane filter는 양전하 성분이므로 음전하를 띠고 있는 DNA는 filter에 걸린다. 여기에서 걸린 DNA를 washing하여 남은 것만 isopropanol로 처리해준다. Isopropanol은 plasmid DNA를 침전시키므로 우리

Plasmid 추출가능단점EtBr은 강력한 mutagenUltracentrifugation 필요시간이 엄청 오래 걸림 ~24hrAnion Exchange chromatographyDNA는 negative charge를 띄기 때문에 positive charge를 띄는 resin에 붙여서 DNA를 정제하는 방법Elution은 high salt solution을 이용(ex : 1M KCl)Elution 후 Ethanol precipitation 을 거쳐야 한다넓은 pH 범위에서 사용이 가능하며, 뽑힌 DNA는 순도가 매우 좋다Silica membrane(Glass fiber)Chaotropic salt가 있을 시 silica membrane이 negative charge를 띄게 되고, Chaotropic salt로 인한 DNA

plasmid가 genomic DNA보다 훨씬 PCR이 잘되며 일반적으로 50-500bp 정도의 길이가 가장 수월하게 증폭된다.- Protease 같은 단백질이 sample DNA에 많으면 PCR을 시작하기 전에 95 DEG C에서 5분간 끓여 효소를 불활성화 한 후 PCR을 시작한다.5) MgCl2- Taq polymerase의 작용을 위해서는 MgCl2가 필수적이며 대개 1.5mM가 적절하나 경우에 따라서는 1.5-4mMwjd도까지 실험하여 최적의 농도를 찾아야 한다.6) 마스터 혼합물(master mix)- PCR sample의 수가 많을 경우에는 DW, buffer, dNTP, prim